참나물(Pimpinella brachycarpa)의 배발생 관련 PbMYB56의 특성

Characterization of embryogenesis-related PbMYB56 during in vitro differentiation of Pimpinella brachcarpa

  참나물(Pimpinella brachycarpa)의 shoot-tip 절편체로부터 체세포배발생캘러스를 선발하여 현탁배양하였으며 이들 배양세포괴들로부터 유래된 배발생캘러스는 연한 노란색을 띠며 체세포배로 분화되었다. 체세포배는 배양기간이 계속되면 발아되어 어린식물체로 되었으며 식물체 재분화는 암조건에서 초기 2주간 배양했을 때 다소 양호하였으나, 이 후 배양에서는 24 E m 2sec 1의 연속광 하에서 배양했을때 체세포배로부터 식물체로 재분화 빈도 및 식물체 수는 더욱 높았다. 참나물의 체세포배로부터 발아 및 식물체의 재분화에는 0.6 M GA3에서 비교적 용이하게 발아되어 참나물 체세포배의 발생경로를 통해 번식이 가능하였다. 참나물 배발생캘러스로부터 분리한 mRNA로부터 cDNA library를 합성하여 PCR을 수행한 결과 cDNA library로부터 배발생 callus 유래 PbMYB56를 cloning하였다. PbMYB56-cDNA sequence를 토대로 제작된 pMYB56-1(5"-gaaatggctgcaataaaatc-3"), pMYB56-2(5"-cgaggttttgaataatggagac-3"), pMYB56-3 (gaaatggctgcaataaaatc-3")를 이용하여 amplification을 하여 약 2356 bp의 PCR product를 얻었다. 이후 pGEM T-easy vector (pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems ; Promega)에 cloning하여 양방향으로 Automatic sequencing (ALF express)을 하여 기존의 cDNA sequence와 비교 한 개의 1200 bp 크기의 intron 부위를 찾을 수 있었다. 참나물(Pimpinella Brachycapa)에서의 Pbmyb gene은 다소 낮은 copy 수인 약 4개의 copy 수를 가지고 있음을 알 수 있었다. 식물의 developmental stage의 단계별 PbMYB56의 expression pattern 과 expression quantity는 분화된 plant stage에서 가장 많이 발현 되었고 다음으로 shoot와 callus stage에서 발현되는 것을 알 수 있었다. 그러나 callus stage에서는 RT-PCR에 비해 northern hybridization에서 signal이 매우 약해 PbMYB56이 in vitro 분화과정에서 배 발생에 관여하는 specific한 유전자의 기능보다는 transcription regulator로 작용하는 MYB protein으로서 tissue specific gene일 가능성을 보여 주었다.

  Somatic embryogenic calli from shoot-tip explants of Pimpinella brachycarpa were suspension-cultured and selected embryogenic calli were transferred to MS medium containing 0.2 M 2,4-D, 0.5 M BAP and 10.0 M TDZ. Embryogenic calli expanded three-to four-fold and globular embryos were appeared on the surface of a pale-yellow calli grown on MS media containing 10.0 M TDZ only, or in combination with 0.5 M NAA. The embryos seperated from the callus and placed in the liquid MS medium containing 0.6 uM GA3 without 0.2% gelrite. Fully germinated embryos matured into plantlets within 2-3 weeks. Normal plants developed from the somatic embryos and grew forming multiple shoots. To amplify PbMYB56-cDNA sequence from embryogenic callus of Pimpinella brachycarpa, the oligonucleotide primers were syntheisised as primers of pMYB56-1 (5"-gaaatggctgcaataaaatc-3"), pMYB56-2(5"-cgaggttttgaataatggggagac-3"), pMYB56-3 (gaaatggctgcaataaaatc-3"). PbMYB56 was 2356 bp and contained an intron of 1200 bp. PbMYB56 gene had four copies as low copy number. In the developmental stage the expression pattern and expression quantity of Pbmyb gene by RT-PCR showed highly in a whole plant stage with petioles and leaves. Also, expressed in shoots but lowly in embryogenic callus stage. we suggest that this PbMYB56 gene may transcriptionally be regulated and expressed for tissue specific function rather than embryo specific function.