Duchenne형 근이양증에서 PCR을 응용한 Dystrophin 유전자 변이 분석

Mutation Analysis of the Dystrophin Gene by Application of PCR in Duchenne Muscular Dystrophy

목적 : Duchenne형 근인양증에서 나타나는 돌연변이는 유전자 결실 65%, 중복 5%, 그리고 점돌연변이, 다형성, 뉴클레오타이드 소변이 등의 미세병변 30%로 알려져 있다. 유전자 결실은 multiplex PCR이나 Southern blot을 이용하여 검출할 수 있으나, 미세병변은 검출을 위한 여러 연구가 시도되고 있지만 아직 뚜렷한 정론이 내려져 있지 않다. 이에 저자들은 환자의 말초 혈액을 채취하여 게놈 DNA를 분리한 후, PCR과 관련된 분자 진단법을 이용하여 유전자 변이 분석을 하였다. 방법 : 서울대학교 어린이병원 소아과에서 근육 조직 검사에 의하여 Duchenne형 근이양증으로 확진된 환자 중 외래 추적 관찰이 가능한 환자 5례와 그 환자의 모친 혹은 자매 7례 즉 총 12례를 대상으로 하였다. 이들로 부터 말초 혈액을 채취하여 게놈 DNA를 분리하였다. 총 28쌍의 시발체를 이용하여 multiplex PCR을 시행하였다. Exon 중복을 분석하기 위하여 multiplex PCR과 겔밀도측정법을 시행하여 부모와 다음 세대간의 띠강도를 비교하였다. 결실이 발견되지 않은 군은exon 각각에 대한 SSCP 분석과 직접 염기 서열분석을 하였다. 결과 : 혈액 1mL로 부터 게놈 DNA 12-2O㎍을 추출할 수 있었으며 크기는 5kb 이상이었다. 게놈 DNA를 이용하여 muitiplex PCR을 수행하였고 최고 9개의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 유전자 변이는 5례의 환자 중 4례에서 관찰되었다. 결실은 2례에서 관찰되었으며, 위치는 각각 exon 45, 47-53, 그리고 exon 47-49, 53이었다. 중복은 1례에서 관찰되었으며, exon 43에 위치하고 있었다. 결실이나 중복이 관찰되지 않았던 1례에서 미세병변이 관찰되었으며, exon 43의 A 염기 결실과 Intron 49의 C→G transversion 변이가 관찰되었다. 결론 : 저자들은 침습적 기법을 필요로 하는 근육 조직이 아닌 가장 손쉽게 얻을 수 있는 말초 혈액을 채취한 후, PCR, SSCP, 겔 밀도측정법, 직접 염기 서열 분석법 등의 방법을 체계적으로 이용하여 Duchenne형 근이양증에서 나타나는 여러 종류의 유전자 변이를 분석할 수 있었으며, 좀더 많은 증례를 대상으로 한 연구가 필요하리라 사료된다.

Purpose: Large rearrangements in the dystrophin gene is detected in about 65-70% of patients by multiplex PCR or Southern blot, although detection of point mutations and microlesions is currently in progress. The purpose of this study is to carry out mutation analysis of the dystrophin gene by application of PCR-related molecular diagnostic methods in Duchenne muscular dystrophy(DMD). Methods: Five patients diagnosed as a DMD by muscle biopsy, and their first-degree relatives and mothers were enrolled in this study. The genomic DNA was extracted from the peripheral blood lymphocyte. We used a total of 28 pairs of primers including Beggs´ and Chamberlain´s primers. The multiplex PCR was performed in 4 groups; 5´Rxn2, 3´Rxn2, Rxn2, and CRxn2. For exon duplication analysis, multiplex PCR and gel densitometry were carried out by comparing the band intensities among individual bands. For groups with no detectable deletion, single strand conformation polymorphism(SSCP) analysis and direct DNA sequencing method were performed with individual PCR of candidate exons. Results: About 12-20μg of genomic DNA was extracted from 1mL of blood, and the size of DNA was over 50kb. Up to 9 PCR products were made from multiplex PCR using the genomic DNA. Among 5 families with DMD, No. 6 had about 240kb DNA deletion from exon 45 and 47-53, and No. 11 had about 130kb deletion from exon 47-49 and 53. No. 1 showed duplication of exon 43 when the multiplex PCR products were analyzed by a densitometer. When the deletion/duplication negative No. 3 was analyzed by SSCP method, exon 43 and 49 showed abnormal band patterns. The abnormal band pattern of exon 43 was caused by deletion mutation of A residue, which resulted in pretermination of dystrophin synthesis, meanwhile exon 49 showed transversion mutation of C→G at intron 49. Conclusion: Based on the results of this study, the methods of multiplex PCR, SSCP and direct sequencing of PCR products made it possible to analyze several types of mutation of DMD.