본 연구는 Acanthamoeba의 단백질 분해효소에 대한 생화학적 특성과 각막염의 병인에 미치는 역할을 알아보고 양막을 균등화(Homogenize)하여 얻은 양막 균등액(Amniotic Membrane Homogenate)이 단백질 분해효소 억제제로서의 치료 효과를 나타내는지 검색해 보고사 시행하였다. 각막염 환자로부터 분리한 Acanthamoeba castellanii를 배양하여 분비된 단백질 분해효소를 in vitro azocasein assay, activity-PAGE와 여러 기질 분해능을 통하여 그중 가장 강력한 효소를 분리 정제하였다. 정제된 효소는 serine 계열의 단백질 분해효소였으며 분자량과 적정pH는 각각 105kDa과 8.5였고, Fibromectin, IgA, IgG, Fibrinogen 등의 여러 기질을 분해하는 특성을 보였다. 여러 단백질 분해 효소 억제제와 함께 양막 균등액의 단백질 분해 효소 억제 효과를 실험한 결과, 분리 정제한 효소에 대한 뚜렷한 억제 효과를 나타내었으며, 이를 동물 실험을 통해 검증해 보았다. 스테로이드로 전처치한 14마리의 갈색가토를 이용한 동물실험에서, 단백질 분해효소만으로야기된 각막 병변과 Acanthamoeba castellanii에 의해 야기된 각막 병변 모두가 각막 상피 결핍과 기질 침윤 또는 혼탁을 나타내는 등 서로 비슷한 임상 양상을 보였다. 이런 각막 병변은 양막 균등액으로 별다른 부작용 없이 효과적으로 억제되었다/ 본 실험에서 갈색 가토를 이용한 아칸트아메바 각막염의 동물 실험 모델을 성공적으로 만들 수 있었고 아칸트아메바의 단백질 분해 효소는 각막염의 병인에 깊이 관여함을 알 수 있었다. 그리고 양막 균등액이 정제된 단백질 분해효소에 대한 억제효과를 지니고 있어 아칸트아메바로 야기된 각막병변을 억제한 것은, 양막을 치료제로 사용할 수 있는 가능성을 제시하였고 이에 대한 연구가 더 이루어져야 할 것이다(한안지 39:2527~2541, 1998).
This study was Performed to investigate the biochemical properties of Acanthamoeba proteinase, its role in the pathogenesis of Acanthamoeba keratitis and the therapeutic effect of the homogenate of amniotic membrane as a proteinase inhibitors. Acanthamoeba castellanii isolated from the keratitis patient was cultured in PYG medium, in which the excretory and secretory products were analysed. The secretory proteinases of A. castellanii were identified using in vitro azocasein assay, activity-PAGE, and various protein substrate degradation assays, and one of them was purified and characterized. The purified secretory proteinase was a kind of serine proteinase. Its molecular weight was 105kDa and optimal pH was 8.5. It was able to degrade the various protein substrates such as fibronectin, IgA, IgG, fibronogen. The various proteinase inhibitors and the amniotic membrane homogenates were tested in vitro against the purified serine proteinase. The amniotic membrane homogenates markedly showed the inhibitory effect against the enzyme activity and this inhibitory effect was also revealed in animal study. In vivo study, this purified proteinase was injected into 14 pigmented rabbit corneas, pretreated with steroids. The corneal lesions induced by both of the purified proteinase and A. castellanii, showed similar clinical findings each other, in which the stromal infiltration and opacity with epithelial defect was revealed. These corneal lesions were significantly inhibited without any side effects of the amniotic membrane homogenates. Conclusiverly, Acanthamoeba proteinase was closely associated with the pathogenesis of Acanthamoeba keratitis. This study provides a successful animal model of Acanthamoeba keratitis using pigmented rabbit. And the fact that Acanthamoeba-induced corneal lesions were inhibited by the amniotic membrane homogenate, suggested that the amniotic and may be useful as a therapeuticx agents in the future, and therefore further investigative studies are also necessary (J Korean Ophthalmol 39:2527~2541, 1998).
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