인체 대장암 세포주(HT-29)에서 담즙산 합청유도체(HS-1200)의 세포 사망 기전

A Novel Chenodeoxycholic Derivative HS-1200 Induces Apoptosis in Human HT-29 Colon Cancer Cells

목적 : 인체 대장암 세포주인 HT-29에 새로운 CDCA 합성유도체인 HS-1200을처치하여 암세포의 증식에 미치는 영향과 아포토시스 유도 활성을 관찰하고 기전을 연구하고자 하였다. 대상 및 방법 : 지수증식기의 HT-29 세포에 다양한 농도의 CDCA 합성유도체인 HS-1200을 투약하여 IC₅₀를 구하였다. IC₅₀의 농도를 참조하여, 세포 생존능의 실험은 trypan blue exclusion assay를 이용하였고, 아포토시스 유도에 관한 관찰 실험은 agarose gel electrophoresis, TUNEL assay 및 Hoechst staining을 이용하였다. Westerm blotting을 통한 PARP [poly (ADP-ribose) polymerase], caspase-3 및 DFF (DNA fragmentation factor)의 degradation 및 cleavage 등을 관찰하였다. Immunofluorescent method를 통한 cytochrome c 방출 측정 및 미토콘드리아 막전위 측정을 실시하였다. 결과 : HS-1200은 agarose gel electrophoresis 실험에서 DNA ladder의 관찰, TUNEL assay 및 Hoechst staining에서 아포토시스 세포들이 대량으로 관찰되는 결과로 미루어 아포토시스에 의한 세포 사망을 유도하는 것으로 사료되었다. 아포토시스에 의한 세포사망을 검증하기 위한 Western blotting을 통한 PARP cleavage, caspase-3 및 DFF 발현 관찰에서 공히 HS-1200 처치후 4시간 째부터 PARP, caspase-3 및 DFF의 degradation 및 cleavage가 관찰되었다. HS-1200의 아포토시스 유도에 이르는 기전연구에서 미토콘드리아의 역할에 주목하고 시행한 cytochrome c 방출 측정 및 미토콘드리아막 전위 (ΔΨm) 측정에서 공히 cytochrome c 방출 및 미토콘드리아막 전위 (ΔΨm)의 감소가 관찰되었다. 결론 : 인체 대장암 세포주(HT-29)에서 CDCA 합성유도체인 HS-1200을 이용한 세포 증식억제 및 세포 사망 기전 연구에서, 아포토시스의 유도가 HS-1200의 세포 사망 기전에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 이러한 아포토시스의 유도에는 미토콘드리아의 역할이 중요하게 관련되는 것으로 관찰되었다. 상기 결과를 토대로 HS-1200의 항암 치료제로서의 역할에 관한 기초 자료로서 유용성을 제시할 수 있었다.

Purpose : To investigate the growth inhibitory effects, and the underlying mechanism of human colon cancer cell (HT-29) death, induced by a new synthetic bile acid derivative (HS-1200). Materials and Methods : Human colon cancer cells (HT-29) in exponential growth phase, were treated with various concentrations of a new synthetic bile acid derivative (HS-1200). The growth inhibitory effects on HT-29 cells were examined using a trypan blue exclusion assay. The extent of apoptosis was deter-mined using agarose gel electrophoresis, TUNEL assays and Hoechst staining. The apoptotic cell death was also confirmed by Western blotting of PARP, caspase-3 and DNA fragmentation factor (DFF) anal-ysis. To investigate the involvement of mitochondria, we employed immunofluorescent staining of cyto-chrome c and mitochondrial membrane potential analyses. Results : The dose required for the half maximal inhibition (IC₅₀) of the HT-29 cell growth was 100~150 μM of HS-1200. Several changes, associated with the apoptosis of the HT-29 cells, were reveal by the agarose gel eletrophoresis, TUNEL assays and Hoechst staining, following their treatment with 100 μM of HS-1200. HS-1200 treatment also induced caspase-3, PARP and DFF degradations, and the western blotting showed the processed caspase-3 p20, PARP p85 and DFF p30 and p11 cleaved products. Mito-chondrial events were also demonstrated. The cytochrome c staining indicated that cytochrome c had been released from the mitochondria in the HS-1200 treated cells. The mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was also prominently decreased in the HS-1200 treated cells. Conclusion : These findings suggest that the HS-1200 - induced apoptosis of human colon cancer cell (HT-29) is mediated via caspase and mitochondrial pathways.