이중 in situ hybridization 기법을 이용한 흰쥐 뇌의 Vasoactive intestinal polypeptide, Vasopressin 및 Oxytocin mRNA의 발현에 관한 연구

Study on the Expression of Vasoactive intestinal polypeptide, Vasopressin and Oxytocin mRNAs in the Rat Brain using Double in situ Hybridization Technique

비방사성물질과 방사성동위원소를 이용하여 한 조직에서 두 종류의 mRNA를 형태학적으로 확인할 수 있는 이중하이브 리드조직화학 (double in situ hybridization) 기법을 개발하기 위하여 흰쥐 시상하부에서 vasoactive intestinal polypeptide, arginine-vasopressin과 oxytocin에 대한 oligonucleotide를 이용한 하이브리드조직화학 실험을 시행한 결과 다음의 결과를 얻었다. 비방사성동위원소 표지물질을 이용한 하이브리드조직화학 기법은 digoxigenin으로 표지한 후 alkaline-phosphatase를 이용하여 NBT/BCIP로 발색한 군에서 가장 우수한 결과가 관찰되었다. 방사성 동위원소인 35S 표지 probe를 이용한 하이브리드조직화학에서도 사용한 X-ray film이나 nuclear track emulsion의 종류에 관계없이 특이적인 hybridization signal이 관찰되었다. 방사성 동위원소인 35S 표지 probe와 비방사성물질인 digoxigenin을 표지한 probe를 혼합하여 시행한 이중하이브리드조직 화학에서는 nuclear track emulsion으로 K5 emulsion을 사용한 군에서 두 종류의 mRNA가 모두 특이적으로 동시에 관찰되었다. 이 연구에서 적용된 digoxigenin을 이용한 비방사성 하이브리드조직화학 기법과 이중하이브리드조직화학 기법은 신경조 직에서의 다양한 mRNA 발현에 대한 연구에 유용하게 응용될 것으로 생각된다.

The technique of in situ hybridization using synthetic oligonucleotides labelled by non-radioactive method was developed to localize vasoactive intestinal polypeptide, arginine-vasopressin and oxytocin mRNAs in the rat brain. Also double in situ hybridization technique where combination of non-radioactive and radioactive probes were applied was developed to localize 2 neuropeptide mRNAs in single tissue section. The results were as follows; In non-radioactive in situ hybridization methods using digoxigenin-labelled oligonucleotide probe, alkalinephosphates method using NBT and BCIP as substrates gave the best result that specific hybridization signals were observed. In radioactive in situ hybridization methods using 35S-labelled oligonucleotide probe, specific hybridization signals were observed in both nuclear track emulsion and X-ray film autoradiography. In double in situ hybridization methods using combination of 35S-labelled and digoxigenin-labelled oligonucleotide probes, specific hybridization signals were observed in the group where K5 emulsion was applied as nuclear track emulsion. The technique of in situ hybridization using digoxigenin-labelled oligonucleotide applied in this study will be useful as alternative for radioactive in situ hybridization technique. Moreover, combination of non-radioactive and radioactive labelled probes in double in situ hybridization technique will be a useful tool for the simultaneous localization of various mRNAs in single section for the study of various neurotransmitters, neuropeptides, receptors and signal transduction molecules.