배양한 연골세포와 이식편에서 Calcitonin-gene-related Peptide와 Type II Collagen 면역반응 및 형태학적인 변화

Immunohistochemical Reaction of Calcitonin-gene-related Peptide and Type II Collagen and Morphological Changes of Cartilage Implants and Cultured Chondrocytes

성숙한 동물의 관절연골과 갈비연골로부터 연골세포를 분리하는 방법의 확립 및 배양한 두 연골세포의 표현형이 이식 전까지 유지되고 있는지를 type II collagen 면역반응으로 확인하고 이식편의 조직적응성을 calcitonin-gene-related peptide (CGRP)와 type II collagen의 면역반응으로 관찰하고자 하였다. 생후 6개월 된 1.5~2 kg 내외의 성숙한 토끼의 관절연골과 갈비연골로부터 분리된 연골세포를 배양하여 전형적인 표현 형이 유지되고 있는 관절연골세포를 갈비연골막 위에 배양하고 이식하여, 이식 연골에서 CGRP와 type II collagen의 면역반응 및 연골세포의 형태학적인 변화를 조사하였다. 관절연골세포는 일차와 이차 계대배양에서 외형적 표현형을 유지하였으나, 갈비연골세포는 섬유모세포 모양의 세포로 표현형이 변화되었다. 관절연골세포를 갈비연골막에 접종했을 때 활착력이 좋았고 부착된 세포들은 납짝해지면서 가장자 리에 연골을 형성하고 있었다. 관절연골세포와 갈비연골세포의 배양에서 모든 연골세포들의 type II collagen 반응이 소실하지는 않았다. 성장이 빠르고 표현형을 잘 유지한 관절연골세포를 이식하여 형성된 이식편의 CGRP 면역반응은 전체적으로 증가하였으며, type II collagen 면역반응은 감소하였다. 전자현미경 소견에서 배양된 관절연골세포는 매우 크고 밝은 핵과 세포질내 소수의 과립들, 소포들이 풍부하였으나, 배 양시간이 경과하면서 핵이 위축되고 세포질내 많은 큰 공포들이 관찰되었으며, 갈비연골막위에 배양하면 세포막아래에 분절상으로 배열하고 있는 과립세포질세망들과 가늘고 짧은 융모들이 관찰되었다. 배양한 관절연골세포는 전형적인 연골세포의 형태를 유지하며 type II collagen 반응은 소실되지 않았다. 관절연골세포는 거의 완전한 세포소기관과 뚜렷한 핵소체와 활성화된 염색질을 가지고 있었고, 갈비연골막 접종에서는 분절상 과립세포질세망들로 보아 증식하는 미성숙한 연골세포의 형태를 나타내었다. 이식한 부위의 관절연골세포는 시간경과에 따라 세포소기관들이 소실되었으며, CGRP에 의해서 변성이 일어나 type II collagen 반응이 점차 감소된다는 것을 알 수 있었다.

The purpose of this study was to investigate the immunohistochemical reaction of calcitonin-gene-related peptide (CGRP) and type II collagen and also morphological changes of cartilage implants and cultured chondrocytes isolated from the articular and costal cartilages. The chondrocytes were isolated from the head of the femur and the 11th costal cartilage of the 6 months old rabbits. De novo implants were prepared from the chondrocytes cultured on the perichondrium by culturing isolated articular chondrocytes. Cultured chondrocytes and implants were evaluated by immunohistochemical staining of CGRP and type II collagen and electron microscopy. Articular chondrocytes maintained the typical phenotype in the 1st and 2nd subcultures, but the costal chondrocytes were transformed into fibroblast-like cells. The articular chondrocytes cultured on the perichondrium were more flattened and formed the cartilage. Most chondrocytes were no loss of type II collagen immunostaining by culturing. Implants replaced by the cultured articular chondrocytes were generally increased CGRP and decreased type II collagen immunoreaction. Electron microscopically the cultured articular chondrocytes had a large euchromatic nucleus, a few granules, and abundant vesicles. During culture, the nucleus became atropy and the cytoplasm contained many large vacuoles. The chondrocytes cultured on the perichondrium showed a lot of segmented rough endoplasmic reticulum and fine short microvilli. During culture, articular chondrocytes maintained typical phenotype and type II collagen reaction. The cultured articular chondrocytes had some organelles and euchromatic nucleus with prominent nucleolus. The chondrocytes cultured on the perichondrium showed active secretion of the matrix with small vesicles and well developed endoplasmic reticulum. The implanted articular chondrocytes showed the decrease of their organelles after secretion of the marix and became increased CGRP and decreased type II collagen immunoreaction.