항사독제제 개발을 위한 agkistrodon 속 한국산 살모사 사독의 면역학적 특성 연구

Immunological characterization of the venoms from Korean snakes of the genus agkistrodon for therapentic antivenin production

우리나라에서 뱀 교상환자 치료에 효율적으로 사용할 수 있는 우수한 항독소 제제를 개발하기 위한 기본 연구로서 국내 서식 살모사 독소와 이에 대한 토끼 및 말 항독소를 이용하여 전기영동 및 웨스턴블럿 분석, 주요 성분에 대한 효소 활성과 항사독의 중화능력 평가를 위한 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 국내 서식 살모사 3종 사독을 전기영동한 결과 살모사 종의 경우 단백질 전기영동 상에 있어 개체별로 거의 차이 없이 일정한 양상을 나타내었으나, 쇠살모사와 까치 살모사의 경우에는 상당한 개체별 다양성을 나타내었다. 2. 주요 공통 사독 성분으로 15kDa과 25kDa band를 확인하였고 이에 대한 N-말단 아미노산 서열 분석에 의해 이들이 각각 PLA₂및 metalloprotease에 속하는 효소임을 확인할 수 있었다. 3. 웨스턴블럿 결과 살모사독에 대한 가토 항혈청은 모든 종의 사독과 일본 표준 출혈독 및 치사독에 대해 우수한 교차반응을 보였으며 또한 마 항독소는 살모사독에 대해 치사 중화능을 보여 살모사독에 대한 항독소가 국내 교상 치료에 유용할 것으로 제시되었다. 4. 살모사독은 음이온-교환 column으로 분획하였을 경우 5개의 peaks로 분리되었고 crude venom proteins의 치사가 (LD₅₀는 30.8 ㎍인데 비하여 unbound basic proteins는 24.8㎍, main basic fraction proteins는 63 ㎍이상인 것으로 나타났다. 사독내 PLA₂는 15.2kDa의 단일 단백질로 정제되었으며 자체 마우스 치사활성은 낮은 것으로 평가되었다.

The aim of this study was to evaluate immunological characteristics, toxicities and the biological activities of the venoms from Korean snakes, in order to select optimal antigen for therapeutic antivenin production and for standardization of the venoms and antivenom in potency test. Two bands(15 and 25 kDa) on electrophoretic mobilities were conserved in most of the venom samples. Immunoblot with antisera against Agkistrodon brevicaudus showed good antigenic cross-reactivity in all venoms used. The 0.71 mg of the antivenom neutralized 2.8 LD₅₀ of A. brevicaudus, 4.5 LD₅₀ of A. ussuriensis, 3.9 LD₅₀ of A. saxatilis, respectively. By the cation-exchange chromatography the crude A. brevicaudus venom was separated into 5 pooled fractions. The minimal hemorrhagic dose of crude venom, unbound and main basic proteins were calculated as 1.7 ㎍, 9 ㎍, and more than 50 ㎍, respectively, and their lethal activities(LD₅₀) were 30.8 ㎍, 24.8 ㎍, and more than 63 ㎍, respectively. The purified phospholipase A₂(PLA₂) was identified as a single band of 15.2 kDa and had little hemorragic and lethal activities and the anti-PLA₂ serum was negative for the neutralization abilities against the venom.