병리학에서의 CRISPR 시스템 적용

CRISPR application in Pathology : Specificity Assessment of CRISPR Genome Editing of Oncogenic EGFR Point Mutation with Single-Base Differences

CRISPR 시스템에서 Cas 단백질과 가이드 RNA 복합체는 완벽한 서열 상보성으로 표적 DNA를 인식하고 절단한다. CRISPR 시스템은 DNA 돌연변이에 의해 유발되는 암, 유전적 장애 등 다양한 질병에 대한 정밀 유전자 치료의 적용 가능성을 가지고 있다. 그럼에도 불구 하고 여러 연구에서는 서열 상보성에 의한 DNA 표적이 불완전하며, 유사한 서열을 가진 비표적 게놈 부위에 예상치 못한 돌연변이를 유발하는 off-target 효과를 확인했다. 이러한 off-target 효과는 CRISPR의 병리 적용에서의 심각한 안전 문제이다. 예를 들어, 단일 염기 돌연변이를 표적으로 할 때, 정상 야생형 대립 유전자는 단 하나의 염기 차이만으로도 off-target이 될 수 있다. 본 연구에서는 PAM 서열 내에 단일 염기 돌연변이를 배치하여 더 높은 특이성을 갖는 새로운 CRISPR 기술을 평가했다. EGFR 유전자의 발암성 단일 염기 돌연변이에 대한 PAM 기반 및 기존 가이드 RNA 방법의 특이성을 비교하고 분석했다. 결과적으로, PAM 기반 가이드 RNA 방법이 발암성 돌연변이 대립 유전자에 대한 특이성을 크게 향상시켰음을 입증했다.

In CRISPR system, CRISPR proteins and guide RNA complexes recognize and cleave the target DNA with perfect sequence complementarity. CRISPR system has a high possibility for use in precision gene therapy for diverse diseases, such as cancer and genetic disorders, which are induced by DNA mutations. Nevertheless, several studies have identified that targeting the DNA by sequence complementarity is incomplete and causes unexpected genome editing of other genomic sites with similar sequences. These off-target effects are serious safety problems in the therapeutic applications of CRISPR, with particular issues in respect of the genome editing of pathogenic point mutations, where non-mutant wild type alleles can be an off-target with only a single base difference. In our study, we assessed a novel CRISPR technique that has a higher specificity by positioning the mismatches within PAM sequence. We analyzed and compared the specificity of the PAM-based and conventional guide RNA methods on an oncogenic single-base mutation in EGFR gene. The results demonstrated that the PAM-based guide RNA method significantly enhanced the specificity for pathogenic mutant alleles with single-base precision.