핵다면체 바이러스 DNA 단편의 클로닝과 발현 및 바이러스 발현 운반체 제조

Cloning and Expression of Nuclear Polyhedrosis Virus DNA Fragments and Construction of Virus Expression Vector

HcNPV DNA genome을 제한효소 EcoR Ⅰ으로 절단하고, pUC8 plasmid vector를 사용하여 E coli JM 83세포에 형질전환하였다. 4개의 EcoR Ⅰ DNA 단편을 pUC8 plasmid vector의 EcoR Ⅰ 부위에 cloning하고, 그들 DNA를 다시 EcoR Ⅰ으로 절단하여 확인하였다. 이들 재조합체는 각각 LK-1, LK-2, LK-3, LK-4로 명명하였다. 재조합체와 E coli JM83 세포의 전체 단백질 polypeptide를 SDS-AGE로 분석하였다. 그 결과 재조합체 LK-1, LK-2, LK-3는 E coli JM83의 단백질 밴드와는 달리 하나의 새로운 밴드가 나타났다. 새로 나타난 밴드의 분자량은 약 47.5kd이다. 또한, HcNPV DNA 게놈을 제한효소로 절단한 단편상에서 cDNA probe와 혼성화시킨 결과 Kpn Ⅰ은 A 단편(54.5kb), Pst Ⅰ은 F 단편(7.6kb), Pvu Ⅱ은 L 단편(93.34kb) 그리고 Xho Ⅰ은 B와 C 단편(28.4와 23.1kb)에서 양성 반응을 보였다. polyhedrin 유전자의 일부 promoter 부위의 염기서열을 결정하였다. 그 결과 TATA box는 전사 개시 위치로부터 위쪽으로 약 21bp의 polyhedrin 유저자 5' flanking 부위에서 발견되었다. polyhedrin 유전자내 CAAT는 TATA-like box측면 염기에 존재하지 않았다. 또한 4개의 앞뒤로 반복되는 5'-CTAATAT-3와 5'TAAATAA-3'의 염기는 polyhedrin 유전자내 전이 개시 위치로부터 위쪽으로 83과 50과 25bp부위에 존재하였으며, 다른 하나는 전이 개시 위치로부터 아래쪽으로 4bp부위에서 발견되었다. 그리고 polyhedrin 유전자내 전이 개시 위치로부터 위쪽으로 약 83bp부위는 AT(78%)가 매우 많이 존재하였다. Bculovirus 발현 운반체를 구성하기 위해서 pUC8 운반체를 이용하였으며, pUC8운반체의 EcoR Ⅰ 부위를 삽입하여 운반체를 구성하였고, 이를 pBE4라 명명하였다. 또한 pBE4 clone DNA의 cloning 부위중 BamH Ⅰ과 Hind Ⅲ 부위를 이중 절단한 후, 1.1kb의 bovine growth hormone 유전자를 삽입 연결 하였고, 이를 pbGHL1이라 명명하였다. 재조합 바이러스를 제조하기 위하여 pbGHL1 plasmid DNA와 HcNPV DNA를 S. frugiperda 세포에 동시 형질감염시켜 재조합 바이러스를 얻었고, 이를 pbHcL1이라 명명하였다. Bovine growth hormone을 방사성 면역측정 방법으로 측정하였다. 그 결과 pbGHL1은 0.09ng/ml이 생산되었으며, pbHcL1은 0.07ng/ml이 생산되었다.

Baculovirus, H cunea nuclear polyhedrosis virus(NPV) DNA genome was digested with EcoR I endonuclease and transformation in E. coli JM 83 using the plasmid vector pUC8. Four EcoR I site of plasmid vector pUC8 and identified by digestion of the recombient DNAs with EcoR I enzyme. The recombinents are named as LK-l, LK-2, LK-3 and LK-4. The total cell polypeptides of the recombinents and E. coli JM 83 were analyzed on the SDS-PAGE. Recombinents, LK-l, LK-2, and LK - 3 were appeared one new band as comparison with polypeptide bands of E. coli JM 83 cell. The molecular weight of new band was approximately 47.5Kd. The DNA genome was digested with Kpn Ⅰ, Pst Ⅰ, Pvu Ⅱ and Xho Ⅰ restriction endonucleases and hybridized with (a^(32)p)-labelled AcNPV polyhedrin gene cDNA. The probe DNA hybredized to Kpn Ⅰ-A, Pst Ⅰ- F, Pvu Ⅱ-L and Xho Ⅰ-B, C segment. The promoter region of polyhedrin gene of HcNPV genome DNA was sequenced. The sequences identified to the TATA box was found at the 5' flanking region of the polyhedrin gene approximately 21 bp upstream from the transcriptional start site. But CAAT-like box in the polyhedrin gene was not found in the sequences flanking the TATA-like box. Two fragments of tandem repeats with the sequence 5'-CTAATAT-3' and 5'-TAAATAA-3' were found between 83 and 50 or 25 upstream and 4 bp downstream from the translation start site. About 83 bp region upstream from the translational start site was highly AT(78%) rich. pUC8 plasmid vector and EcoR Ⅰ-H fragment were digested with BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ and ligated to be named as pBE4. Bovine growth hormone gene(1.1kb) was inserted into BamH Ⅰ and Hind Ⅲ site of the pBE4 and named as pbGHL1. For the construction of recombinant viral DNA, pbGHL1 plasmid DNA and HcNPV DNA were cotrasfected S. frugiperda cell and selected polyhedra negative plaque, which was named as pBHcL1. Bovine growth hormone production was measured by radioimmunioassay method. The amount of bovine growth hormone produced by pbGHL1 was 0.09ng/ml and 0.07ng/ml in pbHcL1 respectively.