M₁과 M₂ 무스카린성 수용체에서 아미노산 Triplet Repeat의 Site-Mutagenesis가 수용체기능에 미치는 영향

Effects of Site-Mutagenesis of an Amino Acid Triplet Repeat atM₁ and M₂ Muscarinic Receptors on Receptor Function

M₁과 M₂ 무스카린성 수용체의 두 번째 transmembrane domain의 C-말단에는 leucine(L), tyrosine(Y), threonine(T)로 구성된 3중체(triplet)가 있다. 이 3중체는 M₂ 무스카린성 수용체에서는 두 번째 transmembrane domain과 첫 번째 세포외 고리사이의 연접부위에서 LYT-LYT의 반복구조로 존재하며 M₁ 무스카린성 수용체에서는 흥미롭게도 LYT-TYL의 역상구조로 존재한다. 본 연구에서는 site-directed mutagenesis방법을 사용하여 이와 같은 특이한 구조적차이가 두 subtype의 수용체의 기능상 차이와 관련한 역할을 가지고 있는지를 확인하고자 하였다. M₁ 수용체에서는 LYTTYL서열을 M₂ 수용체의 서열에 해당하는 LYTLYT로 mutation시켰으며 M₂ 수용체에서는 LYTLYT8서열을 M₁ 수용체의 서열에 해당하는 LYTTYL로 mutation시켰다. 이와같은 mutation은 M₁과 M₂ 수용체에서 효능제 carbachol의 수용체 결합친화력에 유의한 변화를 주지 않았다. 또한 M₁ 수용체에서의 mutation은 cyclic AMP 증가작용에 대한 coupling은 변화시키지 않고 phosphoinositides (PI) hydrolysis 촉진작용과 세포내 Ca²⁺ 농도 상승을 현저히 증가시켰다. 또한 M₂ 수용체에서의 mutation은 adenylate cyclase 억제에 대한 coupling은 변화시키지 않고 PI hydrolysis 촉진을 약간 증가 시켰다. 이상의 결과는 M₁과 M₂ 수용체에서 LYTTYL/LYTLYT 아미노산 서열의 차이는 두 수용체의 PI hydrolysis에 대한 coupling을 조절하는 역할을 하지만, 두 수용체 사이에서 ligand 결합과 신호전달계의 차이를 구분하는데 중요한 역할을 하지는 않는다.

Both M₁ and M₂ muscarinic receptors contain a triplet of amino acid residues consisting of leucine (L), tyrosine (Y) and threonine (T) at C-terminus ends of the second putative transmembrane domains. This triplet is repeated as LYT-LYT in M₂ receptors at the interface between the second transmembrane domain and the first extracellular loop. Interestingly, however, it is repeated in a transposed fashion (LYT-TYL) in the sequence of M₁ receptors. In this work, we employed site-directed mutagenesis to investigate the possible significance of this unique sequence diversity for determining the distinct differential cellular function at the two receptor subtypes. Mutation of the LYTTYL sequence of M₁ receptors to the corresponding M₂ receptor LYTLYT sequence did not result in a significant change in the binding affinity of the agonist carbachol. The reverse mutation at the M₂ receptor also did not modify agonist affinity. Surprisingly, the LYTLYT M₁ receptor mutant demonstrated markedly enhanced coupling to activation of phospholipase C without a change in its coupling to increased cyclic AMP formation. There was also an enhanced receptor sensitivity in transducing elevation of intracellular Ca²⁺. On the other hand, the reverse LYTLYT{\rightarrow}LYTTYL mutation in the M₂ receptor did not alter its coupling to inhibition of adenylate cyclase, but slightly enhanced its coupling to stimulation of phosphoinositide (PI) hydrolysis. Our data suggest that the LYTTYL/LYTLYT sequence differences between M₁ and M₂ muscarinic receptors are not important for specifying ligand binding and coupling of various subtypes of muscarinic receptors to different cellular signaling pathways although they might play a role in the modulation of muscarinic reseptor coupling to PI hydrolysis.