해충저항성 유전자변형 벼 Agb0101에 대한 PCR 검정

Qualitative and quantitative PCR detection of insect-resistant genetically modified ride Agb0101 developed in korea

살충성 유전자 mcrylAcl을 포함하고 있는 해충저항성 유 전자변형 （GM) 벼 Agb0101이 국내에서 개발되었다． 향후 Agb0101 벼의 환경방출에 따른 모니터링과 이력추적을 위해서는 신뢰성 있는 검출방법의 개발이 필요하다． 따라서， 본 연구에서 해충저항성 GM벼의 사후 안전관리를 위한 정성적 및 정량적 PCR 검정 방법을 개발하였다． 벼 녹말분지효소 유전자 RBE4를 PCR 분석의 내재유전자로 사용하였고， 이의 primer쌍 RBEgh- 1/ - 2는 101bp의 PCR 증폭산물을 형성하였다． 정성 PCR 분석을 위해서 삽입된 T- DNA를 바탕으로 특이 Primer를 제작하였고， 이벤트 특이적 검출 primer의 경우 Agb0101의 도입유전자 및 벼 염색체 DNA 사이의 5``또는3``인접염기부위를 정확하게 특이적으로 PCR 증폭하였다． 반면， 대조구인 각종 작물， 국 내 벼 품종 및 Agb0101과 동일 형질전환 벡터를 갖는 해 충 저 항성 벼 에 서 는 어 떠 한 PCR 증폭산물도 형성하지 않았다. 표준물질로써 내재유전자 및 이벤트 특이적 단편으로 제조된 pRBECrR을 이용한 real- time PCR 분석에 의해 서 정량한계 （LOQ） 가 10 copies 농도의 범위인 것으로 확인되었고, 이의 유효성을 검증하기 위하여 상이한 농도 의 Agb0101시료 （1O, 5, 3 및 I%를 real-time PCR 분석하여 정량검정에 대한 표준편차 및 상대표준편차가 각각 0. 06~0.40 및 3.80, 7.01％ 의 낮은 범위에 포함되는 것을 확 인할 수 있었다． 이들 결과로 본 연구에서 개발된 정성 및 정량 PCR 검정 방법이 해충저항성 GM벼 Agb0101의 모니터링 및 이력추적에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 본다.

Genetically modified (GM) rice Agb0101, which expresses the insecticidal toxin modified cry1Ac (mcry1Ac1) gene, was developed by the Rural Development Administra-tion in Korea. To monitor the probable release of Agb0101 in the future, it is necessary to develop a reliable detection method. Here, we developed the PCR detection method for monitoring and tracing of GM rice. The primer pair (RBEgh-1/-2) from a starch branching enzyme (RBE4) gene was designed as an endogenous reference, giving rise to an expected PCR amplicon of 101 bp. For the qualitative PCR detection, construct- and event-specific primers were de-signed on the basis of integration sequence of T-DNA. Event specific PCRs amplified specifically 5``- or 3``-junction region spanning the native genome DNA and the integrated gene construct, while none of amplified product was shown on crops, rice varieties, and other insect-resistant transgenic rice lines. The event-specific real-time PCR method was performed using TaqMan probe and plasmid pRBECrR containing both rice endogenous gene RBE4 sequence and 5``-junction sequence as the reference molecule. The abso-lute limit of quantification (LOQ) of real-time PCR was established with around 10 copies for one plasmid molecule pRBECrR. Thereafter, the different amounts of transgenic rice (1, 3, 5, and 10%, respectively) were quantified by using the established real-time PCR method, with a range below 19.55% of the accuracy expressed as bias, 0.06-0.40 of standard deviations (RSD), respectively. These results indicate that the qualitative and quantitative PCR methods could be used effectively to detect the event Agb0101 in monitoring and traceability.